Gramo dažymas yra greitas metodas ir naudojamas norint pamatyti bakterijų buvimą audinio mėginyje ir klasifikuoti bakterijas kaip gramteigiamas arba gramneigiamas, atsižvelgiant į jų ląstelių sienelių chemines ir fizines savybes. Gramo dėmės beveik visada naudojamos kaip pirmasis žingsnis diagnozuojant bakterinę infekciją.
Ši dažymo technika pavadinta danų mokslininko Hanso Christiano Gramo (1853–1938) vardu, kuris 1882 m. Sukūrė šią techniką ir 1884 m. Paskelbė ją kaip metodą, skirtą atskirti dviejų tipų bakterijas, turinčias panašius klinikinius simptomus: Streptococcus pneumoniae (taip pat žinomas kaip Streptococcus pneumoniae). Pneumokokų) ir bakterijų Klebsiella pneumoniae.
Žingsnis
1 metodas iš 3: mikroskopo skaidrės paruošimas
1 žingsnis. Pasiruoškite darbui laboratorijoje
Mūvėkite pirštines ir užsiriškite ilgus plaukus, kad išvengtumėte bakterijų užteršto bandinio. Valykite darbo vietą po gaubtu arba kitoje gerai vėdinamoje vietoje. Prieš pradėdami, patikrinkite „Bunsen“degiklį ir įsitikinkite, kad mikroskopas veikia tinkamai.
2 žingsnis. Sterilizuokite stiklo mikroskopą
Jei stiklo stikliukas nešvarus, nuplaukite jį muiluotu vandeniu, kad pašalintumėte aliejų ir nešvarumus. Skaidres valykite etanoliu, stiklo valikliu ar kitu laboratorijos naudojamu metodu.
Žingsnis 3. Padėkite mėginį ant stiklo stiklelio
Galite naudoti „Gram“dažymo techniką, kad padėtumėte nustatyti bakterijas medicininiame mėginyje arba bakterijų, augančių Petri lėkštelėje, kultūrą. Norėdami gauti geriausius rezultatus, naudokite „Gram“dėmę plonais mėginio judesiais. Patartina naudoti mėginius, kurie yra jaunesni nei 24 valandos, nes senesnės bakterijos gali pažeisti jų ląstelių sienas ir gali nereaguoti į Gramo dažymą.
- Jei naudojate audinio mėginį, į stiklinį stiklelį įlašinkite 1-2 lašus. Tolygiai paskirstykite ant stiklelio, kad susidarytų plonas purškiamo mėginio sluoksnis, stumdami jį kitos sterilios stiklo plokštelės kraštu. Prieš atlikdami kitą veiksmą, leiskite jam išdžiūti.
- Jei imate bakterijas iš Petri lėkštelės, sterilizuokite inokuliacijos kilpą Bunseno degiklyje, kol ji užsidegs, tada leiskite jam atvėsti. Naudodami kilpą ant stiklelio lašinkite sterilų vandenį, tada prieš naudodami sterilizuokite ir vėl atvėsinkite, kad surinktumėte nedidelį bakterijų mėginį. Po to švelniai maišykite.
- Sultinyje paruoštos bakterijos turi būti dar kartą išmaišomos naudojant sūkurį, po to imamos su inokuliacijos kilpa, kaip nurodyta aukščiau, nepridedant vandens.
- Jei turite tampono mėginį (paprastai tai daroma su maža rankena medvilniniu galu), palieskite ir švelniai pasukite tamponą virš skaidrės.
Žingsnis 4. Šiek tiek aukšta temperatūra gali gerai ištepti
Šiluma sulaiko bakterijas ant stiklelio, todėl dažymo metu jos lengvai neištirpsta. Greitai du tris kartus bakstelėkite stiklelį virš „Bunsen“degiklio arba kaitinkite skaidrę virš elektrinio stiklelio šildytuvo. Neperkaitinkite, mėginys gali būti pažeistas. Jei naudojate „Bunsen“degiklį, tai turėtų būti maža, bet mėlyna liepsna, o ne didelė oranžinė liepsna.
Arba tepinėlis taip pat gali būti atliekamas metanoliu, į sausą tepinėlį įlašinus 1-2 lašus metanolio, ant stiklelio išdžiovinus likusį metanolį, paliekant jį atvirame ore. Ši technika sumažina ląstelių pažeidimus ir suteikia skaidrų vaizdo foną
Žingsnis 5. Padėkite skaidrę virš spalvinimo dėklo
Dažymo padėklai pagaminti iš metalinių, stiklo ar seklių plastikinių plokščių, kurių viršuje yra minkštas tinklelis. Ant šių tinklelių uždėkite skaidres, kad jūsų naudojamas skystis būtų nusausintas į padėklą.
Jei neturite dažymo padėklo, galite uždėti skaidrę ant plastikinio dėklo, kad atspausdintumėte ledo kubelius
2 metodas iš 3: Gramo dėmių procesas
Žingsnis 1. Užpilkite kristalinio violetinio skysčio ant tepinėlio
Pipete apipurkškite bakterijų mėginį keliais lašeliais kristalinės violetinės spalvos, dar žinomos kaip gencijonų violetinė. Palikite 30-60 sekundžių. Kristalinė violetinė (KV) vandeniniame tirpale atskiriama į KV+ ir chlorido (Cl-) jonus. Šie jonai prasiskverbia į gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sieneles ir ląstelių membranas. KV+ jonas sąveikauja su neigiamai įkrautais bakterijų ląstelių komponentais, suteikdamas ląstelėms purpurinę spalvą.
Daugelis laboratorijų naudoja „Hucker“kristalinę violetinę spalvą, kurioje yra amonio oksalato, kad būtų išvengta kritulių
2 žingsnis. Švelniai nuplaukite kristalinę violetinę
Pakreipkite stiklelį ir plovimo buteliuku apipurkškite nedidelį distiliuoto ar vandentiekio vandens srautą. Vanduo turi tekėti tepalo paviršiumi ir jo negalima purkšti tiesiai ant tepalo. Neskalaukite per daug. Jis gali pašalinti gramteigiamų bakterijų dažymą.
Žingsnis 3. Nuplaukite tepalą jodu, tada nuplaukite
Naudokite lašintuvą, kad nuplautumėte tepalą jodu. Palikite jį veikti mažiausiai 60 sekundžių, tada kruopščiai nuplaukite, kaip aprašyta aukščiau. Jodas, neigiamai įkrauto jono pavidalu, sąveikauja su KV+, sudarydamas didelį junginio kompleksą tarp kristalinės violetinės ir jodo (CV-I junginio kompleksas) vidiniame ir išoriniame ląstelės sluoksniuose. Šis junginių kompleksas išsaugos violetinę kristalinės violetinės spalvos ląstelės viduje, dažytose vietose.
Jodas yra ėsdinanti medžiaga. Vengti įkvėpti, nuryti ar patekti ant odos
Žingsnis 4. Įpilkite spalvoto baliklio, tada greitai nuplaukite
Šiam svarbiam žingsniui paprastai naudojamas 1: 1 acetono ir etanolio mišinys, kurį reikia atidžiai nustatyti. Padėkite stiklelį tam tikru kampu, tada įpilkite spalvoto baliklio, kol skalavimui naudojamame vandenyje nebeliks purpurinės spalvos. Paprastai tai trunka mažiau nei 10 sekundžių arba net mažiau laiko, jei baliklio sudėtyje yra didelė acetono koncentracija. Nedelsdami nutraukite šį veiksmą, nes priešingu atveju dažai iš gramteigiamų ir neigiamų ląstelių taip pat išplauks kristalinę violetinę spalvą, todėl dažymo procesas turi būti kartojamas. Naudodami ankstesnę techniką, nedelsdami nuplaukite perteklinį baliklį.
- Grynas acetonas (95%+) gali būti naudojamas kaip pakaitalas. Kuo daugiau acetono naudosite, tuo greičiau baliklis veiks, todėl reikia daugiau dėmesio skirti laikui.
- Jei jums sunku sekti šio žingsnio laiką, po truputį įpilkite spalvų baliklio.
Žingsnis 5. Pabarstykite tepinėlį ant dažų, tada nuplaukite
Priešinė dėmė, dažniausiai safraninas arba fuksinas, naudojama kontrastui tarp gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų padidinti, nudažant nuspalvintas (išblukusias) bakterijas, t. Y. Gramneigiamas bakterijas, rožines arba raudonas. Palikite bent 45 sekundėms, tada nuplaukite.
Fuksinas intensyviai dažys daugelį gramneigiamų bakterijų, tokių kaip Haemophilus spp ir Legionella spp. Šis metodas tinka pradedantiesiems
Žingsnis 6. Išdžiovinkite stiklelį
Galite išdžiovinti atvirame ore arba išdžiovinti naudodami šiam tikslui parduodamą biblinį popierių. Gramo dažymo procesas baigtas.
3 metodas iš 3: dažymo rezultatų tikrinimas
1 žingsnis. Paruoškite šviesos mikroskopą
Padėkite stiklelį po mikroskopu. Bakterijų dydis labai skiriasi, todėl bendras reikalingas padidinimas gali skirtis nuo 400x iki 1000x. Norint gauti ryškesnį vaizdą, rekomenduojama naudoti objektyvą su panardinamąja alyva. Nuleiskite panardinamąją alyvą ant stiklelio, vengdami judėti, kol varva, kad nesusidarytų burbuliukų. Perkelkite mikroskopo lęšio rankenėlę, kad objektyvinis lęšis užsifiksuotų vietoje ir liestų alyvą.
Alyvos panardinimas gali būti naudojamas tik su specialiai sukurtais lęšiais, o ne ant „sausų“
2 žingsnis. Pabandykite nustatyti gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas
Apžiūrėkite stiklelį šviesos mikroskopu. Gramteigiamos bakterijos atrodo violetinės spalvos, nes kristalinė violetinė yra įstrigusi storoje ląstelių sienelėje. Gramneigiamos bakterijos bus rausvos arba raudonos spalvos, nes krištolinė violetinė skalaujama per plonas ląstelių sienas, į kurias patenka rausvos spalvos kontrastiniai dažai.
- Jei mėginys yra per storas, rezultatas gali būti klaidingai teigiamas. Nuspalvinkite naują mėginį, jei jame yra visos gramteigiamos bakterijos, kad įsitikintumėte, jog rezultatas teisingas.
- Jei naudojate per daug spalvų baliklio, rezultatas gali būti klaidingai neigiamas. Nuspalvinkite naują mėginį, jei jame yra visos gramneigiamos bakterijos, kad įsitikintumėte, jog rezultatas teisingas.
Žingsnis 3. Palyginkite matomus rezultatus su etaloniniu vaizdu
Jei nežinote, kaip atrodo bakterijos, ištirkite etaloninių vaizdų kolekciją, paprastai surūšiuotą pagal formą ir gramo dėmę. Taip pat galite peržiūrėti internetines duomenų bazes [Nacionalinė mikrobų patogenų duomenų bazė, Bakterijos nuotraukose ir daugelyje kitų internetinių svetainių. Kad būtų lengviau atpažinti, žemiau pateikiami dažniausiai pasitaikančių ar diagnozei svarbių bakterijų pavyzdžiai, klasifikuojami pagal jų gramo būklę ir formą.
Žingsnis 4. Nustatykite gramteigiamas bakterijas pagal jų formą
Pagal formą mikroskopu bakterijos taip pat klasifikuojamos, dažniausiai kaip kokosai (sferiniai) arba strypai (cilindriniai). Štai keletas gramteigiamų bakterijų (violetinės spalvos) pavyzdžių pagal jų formą:
- Gram teigiami kokiai dažniausiai stafilokokai (reiškiantys grupės kokus) arba streptokokai (reiškiantys grandininius kokus).
- „Gram teigiami strypai, tokie kaip Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ir Listeria. Strypų bakterijos Actinomyces spp. paprastai turi šakas ar gijas.
Žingsnis 5. Nustatykite gramneigiamas bakterijas
Gramneigiamos bakterijos (rožinės spalvos) dažnai skirstomos į tris grupes. Kokčiai yra sferinės formos, strypai yra ilgi ir ploni, o kokosiniai strypai yra tarp jų.
- Gram neigiami koktai Dažniausias yra Neisseria spp.
- Gram-neigiami strypai pvz., E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas ir daugelis kitų. Vibrio cholerae gali būti vertinamas kaip įprastas stiebas arba sulenktas stiebas.
- Gramneigiamos „kokokoidinės“(arba „kokokobacilos“) lazdelės bakterijos pvz., Bordetella, Brucella, Haemophilus ir Pasteurella
Žingsnis 6. Atidžiai patikrinkite, ar rezultatai nevienodi
Kai kurias bakterijas sunku tiksliai nuspalvinti dėl jų ląstelių sienelių trapumo ar vaškinio pobūdžio. Šios bakterijos gali parodyti purpurinės arba rožinės spalvos mišinį toje pačioje ląstelėje arba tarp skirtingų ląstelių to paties tepinėlio. Bakterijų mėginiai, vyresni nei 24 valandos, gali parodyti šią problemą, tačiau yra ir kai kurių bakterijų rūšių, kurias vis dar sunku nuspalvinti bet kuriame mėginių ėmimo amžiuje. Šių bakterijų identifikavimui reikalingi labiau specializuoti bandymai, pvz., Dažymas rūgštimi, stebėjimas bakterijų kultūroje, TSS auginimo terpė ar genetinis tyrimas.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ir Propionibacterium spp. visos yra gramteigiamos bakterijos, tačiau dažnai nėra aiškiai nudažytos.
- Mažos, lieknos bakterijos, tokios kaip Treponema, Chlamydia ir Rickettsia spp. sunku nudažyti Gramo metodu.
Žingsnis 7. Išmeskite visas likusias eksploatacines medžiagas ir įrangą
Ši atliekų šalinimo procedūra įvairiose laboratorijose skiriasi ir priklauso nuo naudojamų medžiagų. Paprastai dažymo dėkle esantis skystis išmetamas į butelius, pažymėtus kaip pavojingos atliekos. Skaidres pamirkykite 10% baliklio tirpale, tada išmeskite į aštrių daiktų indą.
Patarimai
- Atminkite, kad „Gram“dažymo rezultatai bus geri tik tuo atveju, jei mėginys bus geras. Svarbu informuoti pacientus, kad jie galėtų pateikti gerą pavyzdį (pvz., Skirtumas tarp spjaudymo ir gilaus kosulio, norint gauti skreplių mėginį).
- Kaip spalvos baliklis, etanolis reaguoja lėčiau nei acetonas.
- Laikykitės standartinių laboratorijos taisyklių, kad užtikrintumėte saugumą.
- Praktikai naudokite skruostų tamponą, nes jame yra ir gramteigiamų, ir gramneigiamų bakterijų. Jei matote tik vienos rūšies bakterijas, gali būti, kad baliklio naudojate per mažai arba per daug.
- Norėdami pritvirtinti skaidrę, galite naudoti medinius užsegimus.
Įspėjimas
- Acetonas ir etanolis yra degios medžiagos. Acetonas pašalins aliejų iš rankų, todėl jūsų oda lengviau įsisavins kitas chemines medžiagas. Dėvėkite pirštines ir atsargiai jas naudokite.
- Neleiskite tepinėliui išdžiūti prieš nuplaunant „Gram“dėmę ar priešpriešinį dažymą.
Ko tau reikia
- Tinklo pavyzdys
- Stiklinė skaidrė
- Pipetė
- Mažas ugnies šaltinis arba skaidrių šildytuvas arba metanolis
- Vanduo
- Kristalinė violetinė
- Jodas
- Spalvų baliklis, pvz., Alkoholis arba acetonas
- Safraninas
